產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

樂(lè)業(yè)研發(fā)的Amplex Red膽固醇與膽固醇酯檢測(cè)試劑盒(Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit)是一種 基于探針Amplex Red，利用熒光或吸光度檢測(cè)，快速、高靈敏地對(duì)血清、血漿、組織或細(xì)胞樣品、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等樣品中游離膽固醇、總膽固醇和膽固醇酯含量進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。通常0.5-5μl血清或血漿樣品就足夠用于本試劑盒的熒光法檢測(cè)。

本試劑盒檢測(cè)靈敏度高，線(xiàn)性范圍寬，樣品用量少。本試劑盒采用吸光度檢測(cè)時(shí)，在5-500μM濃度范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系；采用熒光檢測(cè)時(shí)，在0.5-50μM濃度范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。使用本試劑盒進(jìn)行熒光法檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)靈敏度會(huì)顯著提高，可以使用更少量的樣品。

本試劑盒檢測(cè)方法靈活，檢測(cè)速度快，適用范圍廣。本試劑盒不僅可以用熒光檢測(cè)，也可以用吸光度檢測(cè)，熒光檢測(cè)比吸光度檢測(cè)靈敏度約高10倍。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程約30分鐘即可完成。本試劑盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清以及組織或細(xì)胞樣品的檢測(cè)。本試劑盒不僅適合少量樣本的檢測(cè)，也非常適合高通量篩選(High-throughput screening)的自動(dòng)化操作系統(tǒng)。

膽固醇(Cholesterol)，又稱(chēng)膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，分子式為C₂₇H₄₆O，分子量為386.6535。膽固醇廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，尤以腦及神經(jīng)組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量也比較高。膽固醇的溶解性與脂肪類(lèi)似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。膽固醇在血液中存在于脂蛋白中，其存在形式包括高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)。在血液中存在的膽固醇絕大多數(shù)都是和脂肪酸結(jié)合的膽固醇酯 (Cholesteryl ester)，僅有少量的膽固醇是以游離狀態(tài)存在的。

膽固醇是動(dòng)物組織細(xì)胞不可缺少的重要物質(zhì)，它不僅是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組成部分，同時(shí)也是合成膽汁酸，維生素D以及甾體激素的重要原料。膽固醇廣泛參與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞功能，并維持著膜結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性。在正常情況下，機(jī)體在肝臟中合成或從食物中攝取的膽固醇，轉(zhuǎn)化為甾體激素或成為細(xì)胞膜的組分，并使血液中膽固醇的濃度保持相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重病變時(shí)，血液膽固醇濃度會(huì)降低。而在黃疸性梗阻和腎病綜合征患者體內(nèi)，血液膽固醇濃度往往會(huì)升高。高密度脂蛋白有助于清除細(xì)胞中的膽固醇，而低密度脂蛋白超標(biāo)一般被認(rèn)為是心血管疾病的前兆。由于血液總膽固醇含量的升高與動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病存在一定的關(guān)聯(lián)性。所以對(duì)血液中膽固醇含量進(jìn)行檢測(cè)具有重要的臨床意義。

本試劑盒中的Amplex Red是一種對(duì)H₂O₂高度敏感的熒光探針。在辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情況 下，Amplex Red能與H₂O₂ 1:1反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的紅色熒光物質(zhì)試鹵靈(Resorufin)。試鹵靈的最大激發(fā)波長(zhǎng)為571nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為585nm，并且在激發(fā)波長(zhǎng)處有很強(qiáng)的可見(jiàn)光吸收。因此本試劑盒可以用熒光和吸光度兩種方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

本試劑盒的檢測(cè)原理如圖1所示。膽固醇酯(Cholesteryl ester)首先在膽固醇酯酶(Cholesterol esterase)的催化作用下水解生成游離膽固醇(Free cholesterol)和脂肪酸(Fatty acids, FA)，游離膽固醇進(jìn)一步在膽固醇氧化酶(Cholesterol oxidase, Cho)的作用下和氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)生成H₂O₂和膽甾烯酮(Cholestenone) ，再通過(guò)檢測(cè)H₂O₂與Amplex Red的反應(yīng)產(chǎn)物試鹵靈的熒光強(qiáng)度或吸光度來(lái)最終檢測(cè)總膽固醇的含量。試鹵靈的熒光強(qiáng)度和吸光度與膽固醇的含量成正比。如果檢測(cè)時(shí)不使用膽固醇酯酶，那么檢測(cè)出來(lái)的就是游離膽固醇的含量。測(cè)定出總膽固醇和游離膽固醇的含量，二者相減就可以計(jì)算出膽固醇酯的含量。

本試劑盒提供了便捷的檢測(cè)裂解液。對(duì)于細(xì)胞或組織樣品的制備，可以用本試劑盒提供的Buffer A for Metabolic Assay，也可以用異丙醇、甲醇/氯仿(1:2, v/v)等有機(jī)溶劑。經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，本試劑盒提供的檢測(cè)裂解液所制備樣品的檢測(cè)效果與異丙醇或甲醇/氯仿(1:2, v/v)所制備的樣品的檢測(cè)效果相當(dāng)。使用異丙醇制備的細(xì)胞或組織樣品，還可以用于甘油三酯、甘油和游離脂肪酸的檢測(cè)，因此優(yōu)先推薦使用異丙醇。如果樣品僅用于檢測(cè)膽固醇、膽固醇酯和游離脂肪酸的檢測(cè)，不用于甘油三脂和甘油的檢測(cè)，優(yōu)先推薦使用Buffer A for Metabolic Assay。如果使用異丙醇或者甲醇/氯仿(1:2, v/v)所制備的樣品，樣品最終用異丙醇溶解后，樣品檢測(cè)時(shí)如果異丙醇的體積不超過(guò)整個(gè)檢測(cè)體系的10% (即100μl檢測(cè)體系中不超過(guò)10μl)，不會(huì)對(duì)吸光度或熒光檢測(cè)產(chǎn)生顯著影響。

本試劑盒提供的檢測(cè)裂解液有一定的通用性。使用本試劑盒中的Buffer A for Metabolic Assay裂解獲得的細(xì)胞或組織樣品，也可以用于樂(lè)業(yè)生產(chǎn)的其它代謝類(lèi)試劑盒中同樣使用Buffer A for Metabolic Assay進(jìn)行裂解的樣品檢測(cè)，通用性強(qiáng)；而且還可用于檢測(cè)蛋白濃度、進(jìn)行SDS-PAGE或一些較易溶解蛋白的Western檢測(cè)。

按照使用說(shuō)明操作，本試劑盒小包裝可以進(jìn)行100次檢測(cè)，中包裝可以進(jìn)行500次檢測(cè)。